Ann. For. Sci. 49 (1992) 309-319
DOI: 10.1051/forest:19920401

Two-dimensional gel electrophoresis of membrane proteins from ectomycorrhizal fungi

B Henrion and F Martin

INRA, Centre de Recherches Forestières de Nancy, Laboratoire de Microbiologie Forestière, Champenoux 54280 Seichamps, France

Abstract - A membrane fraction was isolated from the ectomycorrhizal fungi Pisolithus tinctorius and Cenococcum geophilum and from eucalyptus ectomycorrhizas using differential centrifugation. This fraction contained microsomes free of mitochondrial or nuclear membranes and enriched in endoplasmic reticulum, Golgi, tonoplast and plasma membranes as determined from an analysis of marker enzymes and electron microscopy observations. Four methods of membrane protein solubilisation were assessed on silver-stained 2-dimensional polyacrylamide gels. Gels with limited background staining and streaking and with clearly resolved polypeptides were obtained when P tinctorius and mycorrhizal proteins were extracted with 2% sodium dodecyl sulphate followed by acetone precipitation. On the other hand, the O'Farrell buffer containing urea and Nonidet P-40 was selected for solubilisation of C geophilum membrane proteins. An optimization of solubilisation procedures is therefore required for each fungal species. The procedures described make possible the resolution required for meaningful qualitative and quantitative electrophoretic analysis of membrane proteins from ectomycorrhizal fungi and mycorrhizas.

Résumé - Analyse électrophorétique bidimensionnelle des protéines membranaires de champignons ectomycorhiziens. La différenciation des ectomycorhizes induit de profondes modifications dans la biosynthèse des protéines des partenaires de l'association symbiotique. Les structures membranaires de l'interface symbiotique sont particulièrement affectées par ce processus développemental et il est apparu nécessaire d'étudier la composition protéique de ce compartiment cellulaire. La présente contribution décrit une technique de fractionnement permettant l'obtention d'une fraction microsomale, ayant un bon degré de pureté, à partir de champignons ectomycorhiziens et d'ectomycorhizes et une étude comparative de plusieurs traitements de solubilisation de protéines membranaires pour leur efficacité et leur compatibilité avec l'obtention de gels d'électrophorèse bidimensionnelle. Une fraction membranaire a été purifiée par centrifugation différentielle à partir du mycélium végétatif des champignons ectomycorhiziens Pisolithus tinctorius et Cenococcum geophilum et d'ectomycorhizes d'eucalyptus. L'observation par microscopie électronique à transmission de cette fraction membranaire (fig 1) confirme l'absence de contaminations par des organelles (mitochondries, noyaux, plastes). L'activité d'enzymes spécifiques des différents types de membranes cellulaires indique que cette fraction est enrichie en membranes plasmalemmiques, tonoplastiques, golgiennes et endoplasmiques (tableaux I et II). La nature des membranes purifiées devrait permettre l'étude des protéines de l'interface symbiotique et du système sécrétoire. Afin d'analyser les protéines de cette fraction microsomale par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 2 dimensions, 4 protocoles de solubilisation des protéines ont été comparés (tableau III). Une solubilisation des protéines membranaires de P tinctorius et de mycorhizes par un tampon contenant 2% de dodécylsulfate de sodium, suivie d'une précipitation acétonique, favorise l'obtention de gels dépourvus de colorations parasites avec des polypeptides bien séparés (figs 3 et 4). Pour solubiliser efficacement les protéines membranaires de C geophilum, il est préférable de recourir au tampon de lyse de O'Far rell, riche en urée et Nonidet-P40 (fig 5). L'analyse électrophorétique des protéines membranaires de différentes espèces fongiques impose donc une optimisation préalable du protocole de solubilisation des protéines. Les protocoles de purification des membranes, de solubilisation des protéines membranaires et d'électrophorèse à 2 dimensions décrits dans cette contribution permettent d'aborder l'étude des modifications de la composition protéique des membranes au cours de la différenciation des ectomycorhizes.

Key words: Cenococcum geophilum / Eucalyptus globulus / Pisolithus tinctorius / ectomycorrhiza / electrophoresis / membrane protein / symbiosis-related protein

Mots clés : Cenococcum geophilum / Eucalyptus globulus / Pisolithus tinctorius / champignon ectomycorhizien / électrophorèse / membrane / protéine de symbiose